1.通過代謝組全基因組關聯研究(mGWAS)鑒定出兩個酚酰胺生物合成基因簇

2. BGC11和BGC7對番茄中酚酰胺多樣性的貢獻

作者為探究BGC11和BGC7核心酶在番茄中的功能，構建了過表達SIAT1.1、SIAT1.2、SIAT1.3、SIDH29和SICV86的轉基因番茄株系。代謝物分析顯示，SIAT1.1/1.3-OE株系中單酰基化Put衍生的酚酰胺增加（圖2A-B），而二酰基化的Put衍生酚酰胺在SIAT1.2-OE株系中過度積累（圖2C）。隨后研究發現CRISPR-Cas9生成的SIAT1.2突變株系(SIat1.2-CR)中二酰化酚酰胺減少，尤其diCou-Put減少近3倍（圖2D），表明BGC11增強了Put衍生酚酰胺多樣性。類似地，SIDH29-OE株系中單酰基化Spd衍生酚酰胺增加（圖2E），而SICV86-OE株系中二酰基化Spd衍生酚酰胺積累更多（圖2F），再次表明了Spd衍生酚酰胺的多樣化。

為研究轉運蛋白SIDTX29如何影響酚酰胺代謝，進一步使用LC-MS測定了酚酰胺積累。結果表明SIDTX29-OE品系中Caf-Spd、Fer-Spd和diCaf-Spd積累明顯增加（圖2G）。BGC7的四個基因共表達使煙葉中的Caf-Spd含量增加了35.4倍（圖2H）。單獨或共表達也導致Caf-Spd的積累顯著增加（圖2H）。研究表明BGC11與Put衍生的酚酰胺，BGC7與Spd衍生酚酰胺的生物合成與修飾、運輸的關系（圖2I）。以上發現強調了BGC11和BGC7這兩個基因簇在番茄酚酰胺多樣性中發揮的關鍵作用。

3. SlMYB13直接正向調控BGC11和BGC7中的基因表達，以促進酚酰胺的積累

接下來，作者通過分析兩個BGC基因簇的表達譜，發現它們主要在根、花、葉、莖、果實中高度表達。熒光定量PCR 驗證了二者的同步表達（圖3A）。共表達網絡分析表明SIMYB13與BGC7和BGC11在花、根中的表達模式的相關性較強。此外，SIMYB13和基因簇均因干旱脅迫和脫落酸(ABA)處理而上調，表明存在脅迫響應調節機制（圖3B和3C）。

為了描述SIMYB13與BGC11和BGC7的12個基因之間的相互調控作用，進一步通過酵母單雜交試驗證實了SIMYB13與基因啟動子的直接相互作用（圖3D）。SIMYB13-OE系顯示BGC7和BGC11基因表達增加，Put衍生和Spd衍生的酚酰胺水平更高（圖3E）。相反，SImyb13-CR系顯示12個基因的表達減弱，且酚酰胺含量減少（圖3F）。綜上所述，SIMYB13正向調控番茄中的BGC11和BGC7，突出了其在促進酚酰胺積累中的作用。

4. BGC11、BGC7和SIMYB13通過促進番茄中酚酰胺的積累提高耐旱性

在進一步的研究中，作者使用表達SIMYB13和核心BGC基因的轉基因品系開展干旱脅迫實驗。結果表明SIAT1.1-OE、SIAT1.2-OE、SICV86-OE和SIMYB13-OE品系比WT植株更耐旱，其中SIAT1.2-OE特別耐旱（圖4A和4B）；相比之下，SImyb13-CR系比WT植株對干旱脅迫更敏感（圖4C）。在水分充足或干旱脅迫條件下，SIat1.2-CR系和WT植株之間沒有顯著差異（圖4D-4F）。SIMYB13-OE、SIAT1.1-OE、SIAT1.2-OE和SICV86-OE系在干旱條件下比WT植株表現出更高的存活率和更高的相對含水量，而SImyb13-CR系則表現出相反的模式（圖4E和4F）。超氧化物歧化酶(SOD)活性測定和丙二醛(MDA)積累試驗表明，與WT植物相比，SIAT1.2-OE和SIMYB13-OE植物的活性氧(ROS)清除能力增強，MDA積累減少（補充圖）。這些結果表明BGC11、BGC7和SIMYB13可以增強番茄的耐旱性。

作者通過分析轉基因植株在干旱脅迫下的ABA水平發現，SIMYB13-OE、SIAT1.1-OE、SIAT1.2-OE和SICV86-OE品系的ABA積累高于WT，而SImyb13CR品系中ABA積累較少（圖4G）。通過RT-qPCR進行檢測，結果表明，干旱脅迫后，ABA合成和信號轉導相關基因在過表達品系中表達增加，而在SImyb13-CR中減少（圖4H-I）。SIat1.2CR與WT在ABA含量或基因表達上無顯著差異。因此，BGC11、BGC7和SIMYB13可以影響ABA含量。

進一步分析結果表明，干旱條件下SIAT1.1-OE、SIAT1.2-OE等植株中酚酰胺（如Fer-Put等）積累高于WT，而SImyb13-CR較低（圖4J）。外源Fer-Put處理WT植物后，ABA含量顯著升高（圖4K），且相關基因表達也增加（圖4L-M）。這表明酚酰胺積累（受BGC11、BGC7和SIMYB13調控）通過增強ROS清除能力和增加ABA來增強番茄耐旱性。

5. 番茄馴化和改良過程中BGC11、BGC7和SIMYB13的自然變異

接下來，為探究BGC11、BGC7和SIMYB13的進化歷史，作者比較了三個番茄亞組之間的核苷酸多樣性(π)。在變異分析中，作者在SIMYB13的CDS區域內發現了一個與Fer-Put、diCou-Put和diCaf-Spd相關的非同義突變。基于該變異，番茄種群被分為兩個單倍型組，即SIMYB13-T^HapA和SIMYB13-G^HapB。SIMYB13-G^HapB的Fer-Put(P = 2.36×10^-9)，diCou-Put（P = 3.15×10^-5）和diCaf-Spd（P = 2.15×10^-9）濃度顯著高于SIMYB13-T^HapA，且在番茄馴化和改良過程中頻率逐漸降低（圖5A）。

同時，作者在煙葉中瞬時表達了SIMYB13-T^HapA和SIMYB13-G^HapB，并發現SIMYB13-G^HapB中酚酰胺的積累量更大（圖5B）。此外，表達這兩種單倍型的SIMYB13-OE株系比WT植株表現出更強的耐旱性；特別是SIMYB13-G^HapB，在干旱條件下保持了更強的ROS清除能力以及更低的MDA水平（圖5C和5D）。以上結果表明，SIMYB13-G^HapB可以調節酚酰胺的積累，并在番茄馴化和改良過程中經歷了負向選擇。

基于上述結果，作者將六個基因單倍型組合為HapA、HapB和HapC三組。結果顯示，HapB品種的酚酰胺積累量遠高于HapA（圖5F、G），耐旱性也更強（圖5H）。經RT-qPCR和代謝組學分析證實，HapB中這些基因的轉錄本上調，酚酰胺積累量增加（圖5I）。以上發現強調了HapB單倍型與酚酰胺含量增加的關聯，HapB的消耗可能是導致番茄耐旱性降低的因素之一。

6. BGC11和BGC7在植物中的進化史

為了進一步探索BGC11和BGC7基因的進化歷史，作者對30個具有進化代表性的物種進行了比較基因組分析。分析表明，發現CPA基因在藻類中存在且保守，而4CL、C3H和UGT基因源于陸生植物祖先。BGC11和BGC7核心基因僅存在于陸生植物中。BGC11和BGC7基因聚集在茄科植物中，馬鈴薯和番茄基因共線性較強。這些發現突出了酚酰胺BGCs在植物適應陸地環境及茄科植物保護中的重要性（圖6）。

考慮到物種的系統發育和全基因組復制的歷史，作者提出了一個進化模型來解釋BGC11和BGC7基因簇的起源。1910萬年前基因組重排影響BGC11，620萬年前串聯重復影響BGC7。這些發現表明，基因簇的形成和多樣化依賴于結構變異和基因得失。在番茄馴化中，BGC11、BGC7和SIMYB13的HapB受負向選擇，導致酚酰胺含量下降，影響耐旱性（圖7）。