轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生促使我們理解成長(zhǎng)和發(fā)展的各個(gè)方面了有了巨大的進(jìn)步。使用各種技術(shù)將一個(gè)單細(xì)胞胚胎植入到偽孕媽媽或用干細(xì)胞植入技術(shù)生成淘汰或基因敲除小鼠。這些實(shí)驗(yàn)昂貴，勞動(dòng)密集，費(fèi)時(shí)和需要好幾個(gè)女的捐助者。精原干細(xì)胞是負(fù)責(zé)生產(chǎn)精子和合適的生殖轉(zhuǎn)換對(duì)象。Nagano等將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒體外感染精原干細(xì)胞，然后異種移植到雄性小鼠睪丸細(xì)胞后產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生。在某些情況下受體小鼠很難接受供體的精原細(xì)胞，其成功率是相當(dāng)?shù)偷摹Ｍ瑯樱瑪y帶lacZ基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒與睪丸生殖細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其成功率為2.8％。植入后的低成功率阻礙了胚胎植入。但是使用慢病毒的實(shí)驗(yàn)，能提高其成功率。
慢病毒pLKO.1 EGFP-F12。病毒滴度可以從 105~106 TU/ml。
麻醉劑：使用50mg/ml胺酮和20mg/ml二甲苯胺噻嗪鹽酸鹽的混合物，并用生理鹽水稀釋終濃度二甲苯胺噻嗪鹽酸9g/L，胺酮1.6g/L。
其他化學(xué)品：Tris-HCl，臺(tái)盼藍(lán)染料，十二烷基硫酸鈉（SDS），氯化鈉（NaCl），EDTA，蛋白酶K，多聚甲醛，甘油，氨芐青霉素（鈉鹽）和卡那霉素，以上試劑均購(gòu)于公司；dNTPs 購(gòu)于Promega公司；Taq聚合酶購(gòu)于New England Biolabs公司。
動(dòng)物麻醉系統(tǒng)（拉斯，型號(hào)901807，VetEquip公司）
光纖照明體視顯微鏡（尼康公司）
PCR儀分光光度計(jì)
UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津公司）
試驗(yàn)動(dòng)物：任何品系的小鼠都可以使用。公鼠好選擇一月齡。本實(shí)驗(yàn)選擇28-32日齡小鼠（CRL：CFW），重約20-25克。
動(dòng)物飼養(yǎng)：按標(biāo)準(zhǔn)配方和無(wú)菌水飼喂；環(huán)境溫度保持在23±20。C；相對(duì)濕度：40-70％；光線：7:0019:00有光線； 19:007:00暗室。
1. 制備高滴度pLKO.1 EGFP-F PURO慢病毒載體。
1）將產(chǎn)生的 LVs，溶解于DPBS溶液。慢病毒的生物效價(jià)決定于受感染的不同濃度病毒稀釋的HEK-293細(xì)胞，病毒一般為105~106 TU/ml。
注意：
a. 病毒應(yīng)分裝保存在80℃，可以保存少1年且病毒滴度無(wú)明顯改變，在-80℃。如果病毒在一星期內(nèi)使用，可以儲(chǔ)存在4℃。
b. 慢病毒能夠感染人體細(xì)胞。應(yīng)穿戴手套和防護(hù)服裝。避免泄漏和飛濺。慢病毒不穩(wěn)定，容易被乙醇，清潔劑或漂白劑溶解。任何泄漏或工作完成后，用乙醇或漂白劑消毒工作區(qū)。
2. 體內(nèi)傳導(dǎo)所需的基因在睪丸
注意：所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，應(yīng)按相關(guān)的指導(dǎo)規(guī)則，在相應(yīng)的權(quán)限和規(guī)定內(nèi)執(zhí)行。以下所有步驟應(yīng)在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行。
1） 向日齡28雄性小鼠腹腔內(nèi)注射三溴乙醇（Avertin）（公司）（2,2溴乙醇和T-戊醇，按體重0.015ml/gm），關(guān)鍵步驟防止麻醉過(guò)量，不當(dāng)?shù)穆樽韯┝靠墒箘?dòng)物致死。
2） 從小鼠腹股溝區(qū)剃毛和消毒。無(wú)菌條件下選擇陰莖前方，正中線皮膚切口，中央切口是的手術(shù)方法，一個(gè)切口取出兩個(gè)睪丸。
3） 切開(kāi)肌肉后，在彎夾鉗的幫助下剝離與腹腔睪丸連著的脂肪層。
4） 使用30號(hào)針頭的注射器刺破睪丸組織，向睪丸間的管狀空間內(nèi)插入含臺(tái)盼藍(lán)染料（0.04％）LV的30號(hào)針頭。添加臺(tái)盼藍(lán)監(jiān)測(cè)在刺入睪丸的準(zhǔn)確性。
5） 向睪丸緩慢注入約10-20mL LV液。
注意：每次注射后，等待30秒后拔出注射器以防止LV回流。注入DNA液的總體積不宜超過(guò)20μL，大量注射的慢病毒可能會(huì)使睪丸破裂。
6） 將注射后的睪丸放回原位，由手術(shù)摘除對(duì)側(cè)睪丸，縫合內(nèi)部和外部的傷口。
注意：在手術(shù)中，不摘除連同睪丸的脂肪或任何其他組織。要用無(wú)菌尼龍線結(jié)扎血管，防止出血，小心不要弄破睪丸。
7） 在縫線的部位涂抹抗生素軟膏（新霉素和多粘菌素B硫酸鹽和桿菌肽鋅粉，Glaxo Smith Kline，印度），保持小鼠于熱板上約1h，麻醉中的動(dòng)物容易蘇醒。
3. 轉(zhuǎn)基因株系的建立
注：在小鼠實(shí)驗(yàn)中，它需要30天左右完成一個(gè)精子的周期：從精原細(xì)胞到精子。
1） 注射后LV30天進(jìn)行交配，注射的動(dòng)物與2個(gè)月齡的野生型（WT）雌性動(dòng)物交配，幼畜出生后通常在22-30天交配。
2） 從3周齡鼠取尾2-3cm進(jìn)行活組織檢查，將其培育在他們?cè)诟啕}的消化緩沖（50 mM Tris HCl，1％SDS，100mM NaCl，100mM EDTA和1200μg/ml蛋白酶K）中，55oC，16h。
注意：將20mg蛋白酶K溶解于1mL無(wú)核酸酶水中。分裝蛋白酶K，并保存在-20°C，任何凍融可能會(huì)使蛋白酶K的失活。
3） 裂解分離DNA，酚氯仿萃取，乙醇沉淀。
注意：苯酚和氯仿對(duì)健康造成危害，戴上手套和保護(hù)眼睛。
4） 用紫外分光光度計(jì)檢查A260nm處260nm / 280nm的比值定量DNA濃度的和純度。
5） 稀釋DNA濃度200ng/μl和進(jìn)行PCR。
4. 采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）篩選轉(zhuǎn)基因小鼠
1） 準(zhǔn)備一個(gè)佳的反應(yīng)混合物體中： 1X Taq酶緩沖液，0.2mM dNTPs，0.25µM上、下游引物， 0.06U的TaqDNA聚合酶和20ng質(zhì)粒或200ngDNA基因組模板。混勻后短暫離心。Peltier Thermal Cycler PTC-200預(yù)熱液體后開(kāi)始鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。（MJ Research, Minnesota, USA）.
2） 設(shè)置引物的PCR循環(huán)條件。根據(jù)1.5％-2％TAE瓊脂糖凝膠分析PCR產(chǎn)物。
注意：每次PCR，野生型基因DNA和無(wú)DNA（模板）作為陰性對(duì)照，表達(dá)轉(zhuǎn)基因的純化質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照。
3） 從F1代起，PCR陽(yáng)性幼鼠應(yīng)與野生型雌性交配產(chǎn)生下一代。通過(guò)近親繁殖轉(zhuǎn)基因后代產(chǎn)生純代系。
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更新時(shí)間：2013-08-29
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