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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC1470-50T/48S
更新時間：2024-04-15
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：2353
010-50973130
產品分類
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一氧化氮（NO）含量檢測試劑盒說明書（酶法測定總NO）
可見分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC1470
規格：50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑三 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
試劑四 | 液體3 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑五 | 液體50μL×1支 | 2-8℃保存 |
顯色液A液 | 2-8℃保存 | |
顯色液B液 | 液體15 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
澄清劑 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 液體1mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑一：臨用前加入1.8 mL蒸餾水，-20℃分裝保存兩周，避免反復凍融；
2、 試劑二：臨用前加入1mL蒸餾水，-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；
3、 試劑二工作液：臨用前根據樣本量按試劑二：蒸餾水=10μL：590μL（15T）的比例配制，當天用完；
4、 試劑三：臨用前取一支加入550μL蒸餾水溶解，-20℃分裝保存兩周，避免反復凍融；
5、 試劑五：臨用前根據樣本數量按照試劑五（V）：蒸餾水（V）=10μL：450μL（11T）的比例配制試劑五溶液，現用現配；
6、 顯色液：臨用前根據樣本數量按照顯色液A液：顯色液B液=1:1充分混勻，現配現用；
7、 澄清劑：臨用前加入15mL蒸餾水，可震蕩或50℃加熱促進溶解。此溶液為飽和溶液，取上清使用即可，2-8℃可保存12周；
8、 標準液：10μmol/mL亞*酸鈉。臨用前取20μL 10μmol/mL標準液，加入780μL蒸餾水，配制成0.25μmol/mL標準液，再取0.25μmol/mL標準液50μL和蒸餾水450 μL混合配制成0.025μmol/mL標準溶液。
產品說明：
一氧化氮（Nitric Oxide，NO）是一種極不穩定的生物自由基，分子小，結構簡單，常溫下為氣體，微溶于水，具有脂溶性，可快速透過生物膜擴散，作為一種新型的生物信使分子，在細胞間及細胞內發揮傳遞信號的作用。其廣泛分布于生物體內各組織中，特別是神經組織中。在機體神經、循環、呼吸、消化、泌尿生殖等系統中也起著十分重要的作用。
NO在體內或水溶液中極易氧化生成NO2-和NO3-，本法利用硝酸還原酶特異性將NO3-還原成NO2-，在酸性條件下，NO2-與重氮鹽磺酸胺生成重氮化合物，進一步與萘基乙烯基二胺偶合，產物在550nm處有特征吸收峰，測定其吸光值，可以計算NO含量。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、低溫離心機、分析天平、水浴鍋/恒溫培養箱、1mL玻璃比色皿、可調式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1. 組織樣本：按質量（g）: 提取液體積（mL）1 : 5~10比例加入提取液（建議稱取0.2g樣本，加入1.0mL提取液），冰浴勻漿后，于4℃，12000rpm，離心15min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。
2. 細菌/細胞樣本：按細菌/細胞數量（104）：提取液體積（mL）500~1000 : 1的比例加入提取液（建議1000萬細菌/細胞加入1.0mL提取液），冰浴超聲破碎細菌/細胞（功率200w，超聲3s，間隔7s，總時間5min），然后于4℃，12000rpm，離心15min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。
3. 液體樣本：直接測定。若液體有渾濁則離心取上清測定。
二、測定步驟
1．可見分光光度計預熱30min以上，調節波長至550nm，蒸餾水調零。
2．操作表：
試劑名稱（μL） | 測定管 | 標準管 | 空白管 |
樣本 | 240 | - | - |
0.025μmol/mL標準液 | - | 240 | - |
蒸餾水 | - | 160 | 400 |
試劑一 | 20 | - | - |
試劑二工作液 | 40 | - | - |
試劑三 | 20 | - | - |
混勻，37℃反應120min | - | - | |
試劑四 | 40 | - | - |
試劑五 | 40 | - | - |
混勻，37℃反應30min | - | - | |
顯色液 | 400 | 400 | 400 |
混勻，常溫靜置10min，于550nm處測定各管吸光值，分別記為A測定、A標準和A空白，計算ΔA測定=A測定-A空白，ΔA標準=A標準-A空白。空白管和標準管只需測1-2次。 | |||
三、NO含量計算
1. 按樣本蛋白濃度計算
NO含量（μmol/mg prot）= ΔA測定×（C標÷ΔA標準）×V樣÷（V樣×Cpr） = 0.025×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr
2. 按樣本質量計算
NO含量（μmol/g 質量）= ΔA測定×（C標÷ΔA標準）×V樣÷（W×V樣÷V樣總） = 0.025×ΔA測定÷ΔA標準÷W
3. 按細菌/細胞數量計算
NO含量（μmol/104 cell）=ΔA測定×（C標÷ΔA標準）×V樣÷（V樣×N÷V樣總） = 0.025×ΔA測定÷ΔA標準÷N
4. 按液體體積計算
NO含量（μmol/mL）= ΔA測定×（C標÷ΔA標準）×V樣÷V樣= 0.025×ΔA測定÷ΔA標準
C標：標準管濃度，0.025μmol/mL；V樣：加入樣本體積，0.24mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g ；N：細菌/細胞總數，以104計。
注意事項：
1、 如果樣本勻漿液離心后上清仍舊渾濁，可直接進行反應，反應后在1mL反應液中加入250μL澄清劑，混勻后靜置5min，離心后取1mL上清測定，這種情況下需將空白管和標準管進行相同處理。
2、 如果?A測定小于0.01，可以增加樣本量后再進行測定；如果?A測定大于0.8，建議將樣本上清用提取液適當稀釋后再進行測定。注意同步修改計算公式。
3、 如果樣本上清有顏色（在550nm下有吸收峰），則需要補測樣本的對照管，即將顯色液用相同體積的蒸餾水代替。在550 nm下測定吸光值A，分別記為 A標準、A測定、A空白、A對照，計算ΔA標準=A標準-A空白，ΔA測定=A測定-A對照。此時試劑盒規格為50T/24S。
實驗實例：
1. 取0.107g玉蘭葉片樣本，加入1mL提取液進行冰浴勻漿，離心后取上清，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算：ΔA測定=A測定-A空白=0.205-0=0.205，ΔA標準=A標準-A空白=0.364-0=0.364，按樣本質量計算得：
NO含量（μmol/g 質量）=0.025×ΔA測定÷ΔA標準÷W = 0.025×0.205÷0.364÷0.107=0.132 μmol/g 質量。
2. 取0.0868g小鼠心臟樣本，加入1mL提取液進行冰浴勻漿，離心后取上清，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算：ΔA測定=A測定-A空白=0.212-0=0.212，ΔA標準=A標準-A空白=0.364-0=0.364，按樣本質量計算得：
NO含量（μmol/g 質量）=0.025×ΔA測定÷ΔA標準÷W = 0.025×0.212÷0.364÷0.0868=0.168 μmol/g 質量。
3. 取240μL牛血清樣本，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算：ΔA測定=A測定-A空白=0.369-0=0.369，ΔA標準=A標準-A空白=0.364-0=0.364，按液體體積計算得：
NO含量（μmol/mL）=0.025×ΔA測定÷ΔA標準 = 0.025×0.369÷0.364=0.025 μmol/mL。
相關發表文獻：
[1] Peng X, Zhu L, Guo J, et al. Enhancing biocompatibility and neuronal anti-inflammatory activity of polymyxin B through conjugation with gellan gum[J]. International journal of biological macromolecules, 2020, 147: 734-740.
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