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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC4760-50T/24S
更新時間：2024-03-23
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：978
010-50973130
產品分類
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α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Af）活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號：BC4760
規格：50T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體80 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 粉劑×2瓶 | -20℃保存 |
試劑二 | 液體70 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 液體1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、試劑一：臨用前取1瓶加入2.667mL蒸餾水，充分溶解，用不完的試劑建議分裝后-20℃保存2周，避免反復凍融。
2、標準品：5 µmol/mL的對-硝基苯*溶液。
產品說明：
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Arabinofuranosidase，α-L-Af）屬于糖基水解酶家族，可以從含有阿拉伯糖殘基的多聚物如阿拉伯木聚糖、阿拉伯聚糖和阿拉伯半乳聚糖等的非還原末端水解生成一個L-阿拉伯糖分子。該酶在半纖維素降解以及果實的成熟軟化過程中有著重要作用。
α-L-Af分解對硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷生成對-硝基苯*，對-硝基苯*在400 nm處有最大吸收峰，通過測定400 nm處吸光值變化可計算得α-L-Af活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、1mL玻璃比色皿、超聲破碎儀、可調式移液槍、研缽/勻漿器、EP管、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、組織：按照組織質量（g）︰提取液體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液）進行冰浴勻漿，然后15000 g，4℃，離心10 min，取上清（若為綠色植物的莖、葉、芽等組織，建議將上清用提取液稀釋5倍后檢測；若為果肉等組織，上清可直接檢測或根據預測定結果稀釋相應倍數后檢測）置于冰上待測。
2、細胞或細菌：先收集細胞或細菌到離心管內，離心后棄上清；按照細胞或細菌數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬個細胞或細菌加入1 mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞或細菌（功率200 W，超聲3秒，間隔7秒，總時間3 min）；然后15000 g，4℃，離心10 min，取上清置于冰上待測。
3、液體：直接檢測。
二、測定步驟
1、 分光光度計預熱30 min以上，調節波長至400 nm，蒸餾水調零。
2、 將5 µmol/mL的對-硝基苯*標準液用提取液稀釋為250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 nmol/mL的標準溶液備用，標準液稀釋可參考下表：
序號 | 稀釋前濃度（nmol/mL） | 標準液體積（µL） | 蒸餾水體積（µL） | 稀釋后濃度（nmol/mL） |
1 | 5000 | 40 | 960 | 250 |
2 | 250 | 500 | 500 | 125 |
3 | 125 | 500 | 500 | 62.5 |
4 | 62.5 | 500 | 500 | 31.25 |
5 | 31.25 | 500 | 500 | 15.625 |
6 | 15.625 | 500 | 500 | 7.8125 |
備注：實驗中每個標準管需300µL標準溶液。
3、 操作表：(在1.5 mL離心管中)
試劑名稱（µL） | 對照管 | 測定管 | 標準管 | 空白管 |
試劑一 | - | 200 | - | - |
蒸餾水 | 200 | - | 200 | 500 |
樣本 | 300 | 300 | - | - |
標準溶液 | - | - | 300 | - |
渦旋混勻，置于37℃水浴鍋/恒溫培養箱中準確反應30 min | ||||
試劑二 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
渦旋混勻，吸取1 mL于1 mL玻璃比色皿中，測定400 nm處吸光值A，分別記為A對照管、A測定管、A標準管、A空白管。計算ΔA測定=A測定管-A對照管，ΔA標準=A標準管-A空白管。每個測定管需設一個對照管，標準曲線和空白管只需檢測1-2次。 | ||||
三、α-L-Af活性計算
1、 標準曲線的繪制：
根據標準管的濃度（x，nmol/mL）和吸光度ΔA標準（y，ΔA標準），建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA測定（y，ΔA測定）帶入公式計算樣本濃度（x，nmol/mL）。
2、 α-L-Af活性的計算：
（1）按蛋白濃度計算
酶活定義：每mg蛋白每小時產生1 nmol對-硝基苯*為1個酶活力單位。
α-L-Af酶活（U/mg prot）= x×V提取÷（V提取×Cpr）÷T=2x÷Cpr
（2）按樣本質量計算
酶活定義：每g樣本每小時產生1 nmol對-硝基苯*為1個酶活力單位。
α-L-Af酶活（U/g 質量）= x×V提取÷W÷T= 2x÷W
（3）按照細胞或細菌數量計算
酶活定義：每104個細胞每小時產生1 nmol對-硝基苯*為1個酶活力單位。
α-L-Af酶活（U/104 cell）= x×V提取÷細胞數量（萬個）÷T= 2x÷細胞數量（萬個）
（4）按液體體積計算
酶活定義：每mL樣本每小時產生1 nmol對-硝基苯*為1個酶活力單位。
α-L-Af酶活（U/mL）=x×V樣÷V樣÷T=2x
V提取：提取液體積，1 mL；V樣：加入的樣本體積，0.3 mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質量，g；T：反應時間，0.5 h。
注意事項：
1、 A或ΔA大于1時，建議將樣本用提取液稀釋后再進行測定。
2、 正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定，若濃度過高，建議將樣本用提取液稀釋適當倍數后再進行測定，并在計算公式中乘以稀釋倍數；若濃度過低，建議在粗酶液提取時增加組織質量。
3、 加入試劑二后，建議5 min內讀取OD值。
實驗實例：
1、 取0.1g香蕉進行樣本處理，取上清后，按測定步驟操作，測得計算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.234-0.105=0.129，帶入標準曲線y=0.0037x+0.0029，計算x=34.08，按樣本質量計算酶活得：
α-L-Af酶活（U/g 質量）=2x÷W=2×34.08÷0.1=681.6 U/g 質量。
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