bca法測(cè)蛋白濃度原理

bca法測(cè)蛋白濃度步驟步驟

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：反應(yīng)體系

加樣：96孔板，第一列8個(gè)孔

PBS: 20ul  19ul   18ul   16ul   12ul   8ul   4ul   0ul

BSA :0ul   1ul     2ul    4ul    8ul   12ul  16ul  20ul

BCA:200ul  200ul  200ul  200ul  200ul 200ul  200ul  200ul

BCA需現(xiàn)配現(xiàn)用，比例為A:B為50:1

樣品需稀釋25倍或根據(jù)實(shí)際情況決定

37℃水浴箱中孵育半個(gè)小時(shí)，用酶標(biāo)儀讀數(shù)

酶標(biāo)儀設(shè)置：

選擇absorbance可見(jiàn)光吸光度，波長(zhǎng)設(shè)置為562nM，濃度從低到高分別為0

0.025ug/ul，0.05ug/ul，0.1ug/ul，0.2ug/ul，0.3ug/ul，0.4ug/ul，0.5ug/ul，設(shè)置第一列為標(biāo)準(zhǔn)列，設(shè)置樣本及Blank對(duì)照。

讀出OD值后，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)樣本的OD值算出樣本濃度，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R值越接近1，說(shuō)明曲線擬合度越好。         

注意：BCA測(cè)定時(shí)，顏色會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷加深，并且顯色反應(yīng)的速度和溫度有關(guān)，所以除非精確控制顯色反應(yīng)的時(shí)間和溫度，否則每次都需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品在20-2000ug/ml的濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，因此樣品濃度過(guò)高需適當(dāng)稀釋。