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專注于生物學試劑及試劑盒領域
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產品型號：BC4345-100T/48S
更新時間：2024-04-16
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1043
010-50973130
產品分類
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亞鐵氧化酶（HP）活性檢測試劑盒說明書
微量法
貨號：BC4345
規格：100T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
試劑一 | 液體20 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體3 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 液體1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、試劑三：臨用前加入6 mL蒸餾水溶解備用，用不完的試劑2-8℃保存4周。
2、標準品：9 µmol/mL的亞鐵離子標準液。
產品說明：
亞鐵氧化酶（Hsphasetin，HP）是銅藍蛋白的同系物，催化亞鐵離子（Fe2+）氧化為三價鐵離子（Fe3+），從而三價鐵與轉鐵蛋白結合，參與細胞鐵釋放。
以一定濃度的Fe2+ 為底物，在亞鐵氧化酶的催化作用下Fe2+ 被氧化為Fe3+，Fe2+ 與菲咯嗪形成有色復合物，在562 nm處有特征吸收峰，先計算出未被氧化的Fe2+ 的含量，進而得出被氧化的Fe2+ 的含量，可通過Fe2+被氧化的速率來反映亞鐵氧化酶活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、可調式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、EP管。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、組織：按照質量（g）︰蒸餾水體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1 g，加入1 mL蒸餾水）加入蒸餾水，冰浴勻漿后于10000 rpm，4℃離心10 min，取上清置于冰上待測。
2、血清或血漿：建議用蒸餾水將血清或血漿稀釋2~4倍后直接檢測。若溶液渾濁則離心取上清置于冰上待測。
二、測定步驟
1、 分光光度計/酶標儀預熱30 min以上，調節波長至562 nm，分光光度計蒸餾水調零。
2、 標準液的稀釋：將9µmol/mL的亞鐵離子標準液用蒸餾水倍比稀釋為360、180、90、45、22.5、11.25、5.625 nmol/mL的標準溶液備用。
3、 標準液稀釋可參考下表：
序號 | 稀釋前濃度（nmol/mL） | 標準液體積（µL） | 蒸餾水體積（µL） | 稀釋后濃度（nmol/mL） |
1 | 9000 | 40 | 960 | 360 |
2 | 360 | 500 | 500 | 180 |
3 | 180 | 500 | 500 | 90 |
4 | 90 | 500 | 500 | 45 |
5 | 45 | 500 | 500 | 22.5 |
6 | 22.5 | 500 | 500 | 11.25 |
7 | 11.25 | 500 | 500 | 5.625 |
備注：實驗中每個標準管需40µL標準溶液。
4、 操作表：在1.5 mL離心管（分光光度計）或96孔板中依次加入下列試劑：
試劑名稱 | 對照管 | 測定管 | 無基質管 | 空白管 | 標準管 |
蒸餾水（µL） | - | - | 8 | 8 | 8 |
樣本（µL） | 8 | 8 | - | - | - |
試劑一（µL） | 112 | 112 | 112 | 112 | 112 |
用移液槍充分吹打混勻 | |||||
試劑二（µL） | - | 40 | 40 | - | - |
標準溶液（µL） | - | - | - | - | 40 |
蒸餾水（µL） | 40 | - | - | 40 | - |
混勻，37℃水浴鍋或恒溫培養箱中準確反應3 min | |||||
試劑三（µL） | 40 | 40 | 40 | 40 | 40 |
混勻，于微量玻璃比色皿/96孔板中測定562 nm處吸光值A，分別記為A對照管，A測定管、A無基質管、A空白管和A標準管。計算ΔA測定=（A無基質管-A空白管）-（A測定管-A對照管），ΔA標準=A標準管-A空白管。每個測定管需設一個對照管，同一批次無基質管、空白管和標準管只需測1-2次。 | |||||
三、亞鐵氧化酶活性計算
1、 標準曲線的繪制：
以各個標準溶液的濃度（nmol/mL）為x軸，其對應的ΔA標準為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程y= kx+b，將ΔA測定帶入方程得到樣本濃度（x，nmol/mL）。
2、 亞鐵氧化酶活性的計算：
（1）按照樣本蛋白濃度計算
酶活定義：每mg蛋白每分鐘氧化1 nmol的Fe2+ 定義為1個酶活力單位。
亞鐵氧化酶酶活（U/mg prot）= x×V試劑二÷（V樣×Cpr）÷T ×N= 1.667x÷Cpr×N
（2）按照樣本質量計算
酶活定義：每g樣品每分鐘氧化1 nmol的Fe2+ 定義為1個酶活力單位。
亞鐵氧化酶酶活（U/g鮮重）= x×V試劑二÷（V樣×W÷V提取）÷T×N = 1.667x÷W×N
（3）按液體體積計算
酶活定義：每mL樣本每分鐘氧化1 nmol的Fe2+ 定義為1個酶活力單位。
亞鐵氧化酶酶活（U/mL）= x×V試劑二÷V樣÷T×N = 1.667x×N
V試劑二：加入的試劑二體積，0.04 mL；V樣：加入的樣本體積，0.008 mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質量，g；T：反應時間：3 min；N：稀釋倍數。
注意事項：
1. 當A測定低于0.1時，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進行測定，計算公式中乘以稀釋倍數。
實驗實例：
1、 取0.1g結腸，進行樣本處理，按照測定操作步驟，測得計算ΔA測定 =（A無基質管-A空白管）-（A測定管-A對照管）=（1.144-0.041）-（1.114-0.048）=0.037，帶入標準曲線y = 0.0031x - 0.0007，計算x=11.710，按照樣本質量計算酶活得：
亞鐵氧化酶酶活（U/g質量）= 1.667×x÷W×N= 1.667×11.710÷0.1=195.161 U/g質量。
2、 取兔血清，按照測定操作步驟，測得計算ΔA測定=（A無基質管-A空白管）-（A測定管-A對照管）=（0.577-0.048）-（1.114-0.048）=0.574，帶入標準曲線y = 0.0031x - 0.0007，計算x=184.935，按照液體體積計算酶活得：
亞鐵氧化酶酶活（U/mL）= 1.667×x=1.667×184.935=308.287 U/mL
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